Blog

Colture cellulari: modello di ricerca in vitro

By Centro di Biotecnologie In Senza categoria

 

 

Le tecniche di coltura cellulare hanno permesso di studiare il comportamento  delle cellule al di fuori dell’organismo vivente in condizioni artificiali che riproducano, quanto più fedelmente possibile, il microambiente del tessuto o dell’organo da cui derivano. Gli esperimenti eseguiti su cellule in coltura vengono definiti in vitro per distinguerli da quelli in vivo che sono eseguiti sull’organismo vivente. Le colture tissutali e cellulari interessano molteplici aree della ricerca scientifica.

Tra le possibili applicazioni ricordiamo:

• lo studio della regolazione della vita cellulare e della risposta a stimoli esterni in condizioni controllate;
• la verifica dell’effetto di vari composti chimici e farmaci su specifici tipi cellulari (per es., le cellule tumorali);
• lo studio dell’utilizzo delle cellule per la generazione di tessuti in provetta (per es., pelle artificiale);
• la sintesi di prodotti biologici su larga scala (per es., proteine per uso terapeutico).

Come sono nutrite le cellule in coltura?

Nell’organismo vivente le cellule si mantengono vitali grazie all’apporto di sostanze nutritive, garantito dal sistema vascolare che, tramite la rete capillare, nutre il tessuto a livello cellulare e rimuove i prodotti di scarto, derivati dal metabolismo cellulare. In vitro le funzioni dell’apparato vascolare sono vicariate dal terreno di coltura, un mezzo liquido altamente nutritivo. Esso è costituito da sostanze di base, quali glucosio, amminoacidi, vitamine, sali minerali ed elementi presenti in traccia, necessari per le normali funzioni fisiologiche della cellula, e dal siero animale, che sostiene la crescita e la proliferazione cellulare. Il siero viene nella maggior parte dei casi usato alla concentrazione del 5-20% e contiene fattori di crescita, come il fattore di crescita piastrinico (PDGF), il fattore di crescita epidermico (EGF), fattori di crescita insulino-simili (IGF), ormoni, lipidi importanti come fonte energetica e per la sintesi della membrana plasmatica, fattori adesivi quali fibronectina e vitronectina, transferrina, importante per il metabolismo del ferro, e albumina, capace di trasportare vitamine e lipidi.

Le cellule devono essere nutrite regolarmente in condizioni asettiche per garantirne la vitalità. Le cellule normali aderiscono a superfici di vetro o di plastica trattata e proliferano fino a formare un monostrato confluente che ricopre completamente la superficie del contenitore (capsula di Petri o fiasca). Per garantire il mantenimento delle cellule in un microambiente simile a quello nativo, le cellule in laboratorio sono tenute in incubatore a 37 °C ad atmosfera controllata (95% aria, 5% CO₂), ciò che consente di mantenere il corretto pH cellulare. A seconda del tessuto di provenienza, le cellule possono necessitare dell’aggiunta al terreno di coltura di fattori specifici, in modo da conservare lo stesso grado di proliferazione e differenziamento.

Come si prepara una coltura cellulare?                                               

La prima tappa nell’allestimento di una coltura cellulare consiste nell’isolare la popolazione di cellule desiderata a partire da un frammento di tessuto; ad un’iniziale disaggregazione meccanica del tessuto si fa seguire la digestione enzimatica, per degradare la matrice extracellulare che circonda e mantiene unite le cellule. La popolazione cellulare così ottenuta è eterogenea, ma, utilizzando terreni di coltura selettivi oppure separando le cellule in base alle molecole espresse sulla membrana citoplasmatica (antigeni), è possibile isolare specifiche popolazioni cellulari. Le cellule isolate vengono poi fatte crescere in un terreno di coltura appropriato; queste proliferano e, raggiunta la confluenza, possono essere staccate e trasferite in un altro contenitore, per mantenerle in continua divisione

I differenti tipi di colture cellulari

Una coltura cellulare si definisce ‘primaria’, quando deriva direttamente dal tessuto, o ‘secondaria’, se proviene da cellule di un’altra piastra. In base alla capacità proliferativa la coltura cellulare è detta a ‘termine‘ o ‘linea cellulare continua‘. La coltura a termine è formata da cellule che possono compiere soltanto un numero finito di divisioni dopodiché vanno incontro a morte per il fenomeno dell’invecchiamento cellulare, indipendentemente dalla presenza o meno degli appropriati nutrienti. La linea cellulare continua, invece, è una coltura le cui cellule proliferano indefinitamente in seguito a cambiamenti nel loro patrimonio genetico, insorti spontaneamente o indotti dal ricercatore. Inoltre, in base alla capacità delle cellule di attaccarsi o meno a un substrato, le colture vengono distinte in ‘aderenti‘ (per es., cellule dell’epidermide) o ‘in sospensione’ (per es., cellule emopoietiche).

Applicazione : La costruzione di tessuti complessi

Lo sviluppo delle conoscenze della biologia cellulare integrate con quelle della bioingegneria ha aperto il campo all’ingegneria tissutale, che propone l’utilizzazione delle cellule per la costruzione in laboratorio di tessuti biologici artificiali da usare come sostituti di quelli danneggiati in seguito a malattia o trauma. Ciò aiuterebbe a risolvere i problemi della ridotta disponibilità di organi per trapianto e il rischio di rigetto dell’organo trapiantato derivato da donatore. L’associazione di cellule con materiali biocompatibili e biodegradabili ha portato alla produzione di tessuti ingegnerizzati trapiantabili. Gli attori coinvolti nello scenario biotecnologico della rigenerazione tissutale sono fondamentalmente tre: le cellule, le molecole segnale e i biomateriali. Per garantire il mantenimento della funzione delle cellule impiantate si utilizza un materiale o scaffold che agisce da impalcatura per guidare l’organizzazione tridimensionale delle cellule nel costrutto finale. Lo scaffold, sintetico oppure naturale, deve essere in grado di sostenere la crescita e il differenziamento delle cellule, cioè deve ricreare il più possibile il microambiente caratteristico del tessuto che si vuole sostituire. Una volta trapiantato, esso deve svolgere la funzione di guida nella ricrescita tissutale, prima di essere completamente riassorbito. Per la preparazione dell’impianto da trapiantare, le cellule sono derivate da un frammento di tessuto sano del paziente di cui si vuole ricostruire il tessuto danneggiato; segue la combinazione tra le cellule e il biomateriale opportuno, in presenza o meno di molecole segnale necessarie per il corretto differenziamento delle cellule.

Grande entusiasmo hanno suscitato nella comunità scientifica le cellule staminali quale risorsa nella terapia rigenerativa, grazie alla loro capacità di dare origine a diversi tipi cellulari a seconda di come vengono stimolate.